配资排行稳定性 《Chinese Medicine》

配资排行稳定性

✍导语

归芪白术方（GQBZP）是一种中药方剂，据报道具有抗癌、镇痛和抗炎活性。源自明代朱砂的《普济方》中记载的黄芪汤，由黄芪、白术、当归、芍药、橘皮、川芎和甘草组成。

化疗引起的肠道黏膜炎（CIM），特别是由5-氟尿嘧啶（5-FU）等药物引起的，经常导致化疗中断，有效的治疗方案仍然有限。一篇发表于Chinese Medicine（IF：7.4）的研究揭示了归芪白术方通过靶向IKKβ抑制M1巨噬细胞极化从而减轻5-FU诱导的肠道黏膜炎。

PART 01

题目及作者信息

PART 02

️文献摘要：

【目的】

评估GQBZP对5-FU诱导的肠道黏膜炎（IM）的治疗效果，并阐明其潜在的分子机制和物质基础。

【方法】

本研究利用5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导的肠道损伤（IM）小鼠模型，探讨GQBZP的保护作用及其作用机制。通过虚拟对接结合CCK-8测定法筛选出GQBZP中潜在的IKKβ靶向化合物，并随后在5-FU刺激的人肠上皮细胞（HIECs）和脂多糖/干扰素-γ（LPS/IFN-γ）刺激的THP-1巨噬细胞中进行评估。靶点特异性和结合特性通过分子动力学（MD）模拟、表面等离子体共振（SPR）分析以及使用过表达IKKβ的HEK293T细胞的实验进一步验证。

【结果】

体内实验表明，GQBZP通过抑制肠道组织内的M1型巨噬细胞极化并恢复肠道屏障完整性，显著缓解了5-FU诱导的肠道损伤，这些作用与IKKβ/NF-κB信号通路的调节密切相关。虚拟筛选和CCK-8实验在GQBZP中鉴定出五种靶向IKKβ的化合物：鼠李糖苷、托拉拉酮、橙皮苷、黄连素和肉桂醇。这些化合物显著减少了5-FU处理的HIECs细胞中的细胞凋亡和促炎细胞因子产生。此外，它们抑制了LPS/IFN-γ刺激的THP-1细胞中的M1型巨噬细胞极化和细胞因子释放，并伴随IKKβ/NF-κB通路的激活减弱。分子动力学模拟、SPR实验，在过表达IKKβ的HEK293T细胞中进行的体外功能研究进一步证实，Toralactone直接结合并抑制IKKβ的激活，而Rhamnocitrin则通过间接的调节机制调节IKKβ的活性。

【结论】

GQBZP通过IKKβ/NF-κB依赖性机制促进肠上皮屏障恢复并抑制M1巨噬细胞极化，从而减轻5-FU诱导的肠黏膜损伤，发挥协同抗炎作用。Toralactone被鉴定为直接抑制IKKβ介导的M1极化的关键活性成分。这些发现表明，靶向IKKβ调节巨噬细胞极化是管理肠黏膜损伤的潜在治疗策略。

PART 03

研究思路与方法

研究思路：方药 UPLC‑MS/MS 物质定性→动物体内药效评价→组织病理 + 免疫流式明确巨噬细胞表型→分子虚拟筛选找 IKKβ 候选单体→细胞功能验证→分子动力学 MD+SPR 表面等离子体共振 + 过表达细胞验证蛋白‑小分子直接结合

模块

技术手段

实验目的

方药质控

UPLC‑MS/MS 正负离子模式

表征归芪白术方水煎液化学成分

动物体内实验

5‑FU 诱导小鼠肠黏膜炎；低 / 中 / 高剂量 GQBZP 同步给药；检测体重、腹泻评分、空肠组织病理、紧密连接、炎症因子、巨噬细胞流式、IKKβ/NF‑κB 通路

评价整体药效，明确体内对 M1 巨噬细胞、肠道屏障的作用

体外细胞实验

①HIEC 小肠上皮细胞：5‑FU 造模，单体给药，检测凋亡、炎症因子②THP‑1 巨噬细胞：LPS/IFN‑γ 诱导 M1 极化，单体干预，流式检测 M1/M2、通路蛋白

分别观察上皮、巨噬细胞两个细胞层面效应

虚拟筛选

分子对接，IKKβ（PDB:4KIK），Lipinski 五规则

筛选复方中潜在结合 IKKβ 的小分子化合物

靶点确证

分子动力学 MD 模拟、SPR 表面等离子体共振、IKKβ 过表达 HEK293T 细胞

区分小分子是直接结合 IKKβ，还是间接发挥作用

动物分组：对照组、5‑FU（50 mg/kg，腹腔注射）模型组、5-FU + GQBZP组联合GQBZP‑L（4.45 g/kg）、GQBZP‑M （8.97 g/kg）、GQBZP‑H（17.94 g/kg），每组 n=9；同步给药 7 天。

PART 04

核心亮点

1.体内证实归芪白术方可以同时修复肠道屏障+抑制M1巨噬细胞极化，对抗5‑FU肠黏膜炎；

2.从复方中筛选5个靶向IKKβ的活性化合物；证实Toralactone可以直接结合IKKβ蛋白，是直接作用分子；而Rhamnocitrin为间接调控；

3.5‑FU损伤的小肠上皮细胞本身不激活IKKβ/NF‑κB，炎症主要来源于固有层M1巨噬细胞，解释肠道炎症的免疫细胞来源。

PART 05

研究结果

图1：通过 UHPLC-MS/MS 分析鉴定 GWD 的吸收成分UPLC-MS/MS对GQBZP水煎液中化学成分的初步鉴定

A在正离子模式下获得的总离子图。B在负离子模式下获得的总离子图

图2：GQBZP可减轻5-FU在小鼠中引起的肠道损伤

A实验流程示意图。 B各组小鼠体重百分比变化（n = 7，每组）。 C空肠组织经H&E染色观察（比例尺 = 50 μm）。 D空肠隐窝绒毛比的定量分析（n = 3，每组）。 E空肠隐窝绒毛长度的统计分析（n = 3，每组）。 F–G空肠组织中Ki-67的免疫组化染色及其统计分析（n = 3，每组，比例尺 = 50 μm）。 H–J空肠组织中IL-1β和IL-6的免疫组化染色及其统计分析（n = 3，每组，比例尺 = 50 μm）。 K–L 采用 RT-qPCR 法定量检测 IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 表达水平 (n = 3, 每组)。 M 各组小鼠血清 D-乳酸含量 (n = 5, 每组)。 N–Q ZO-1 和 Occludin 的平均荧光强度统计值 (n = 5, 每组, 比例尺 = 50 μm)。 R–U IKKβ 和 p-IKKβ 的免疫荧光检测及其统计值 (n = 3, 每组, 比例尺 = 50 μm)。 V–Y p65 和 p-p65 的免疫荧光检测及其统计值 (n = 3, 每组, 比例尺 = 50 μm)。 *p < 0.05, **p < 0.01, 与对照组相比；  < 0.05, # < 0.01，与5-FU组相比。

图3：GQBZP抑制IM小鼠中5-FU诱导的空肠M1极化

A–D通过流式细胞术标记的F4/80和CD11b阳性肠道巨噬细胞，CD86标记的M1细胞，CD163标记的M2细胞，以及其统计数据（n = 3，每组）。 E, F通过免疫荧光标记的F4/80和iNOS阳性M1细胞，以及其统计数据（n = 3，每组）。 G, H通过免疫荧光标记的CD206阳性M2细胞，以及其统计数据（n = 6，每组）。单因素方差分析，采用Dunnett多重比较检验。 *p < 0.05, **p < 0.01, 与对照组相比；  < 0.05, # < 0.01, 与5-FU组相比。

图4：靶向IKKβ的GQBZP化合物改善5-FU诱导的HIECs损伤

A, B使用流式细胞术检测HIECs的凋亡情况及其在不同浓度5-FU干预24和48小时后的统计学意义（n = 3，每组）。C, D使用流式细胞术检测HIECs在GQBZP中靶向IKKβ的活性化合物和LY2409881干预48小时后诱导的凋亡情况及其统计学意义（n = 3，每组）。E–G通过ELISA检测各组培养基上清液中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平（n = 5，每组）。采用单因素方差分析结合Dunnett多重比较检验。*p < 0.05, **p < 0.01，与对照组相比； < 0.05，# < 0.01，与5-FU组相比。

图5：源自GQBZP的靶向IKKβ的活性化合物抑制LPS+IFN-γ诱导的THP-1巨噬细胞的M1极化

A, B PE-CD86标记的M1细胞，APC-CD163标记的M2细胞，及其统计数据（n = 3，每组）。 C, D 免疫荧光标记的iNOS标记的M1细胞，及其统计数据（n = 3，每组）。 E–G 各组中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，通过ELISA检测（n = 5，每组）。单因素方差分析，采用Dunnett多重比较检验。 *p < 0.05, **p < 0.01，与对照组相比；  < 0.05, # < 0.01，与LPS + IFN-γ组相比。

图6：GQBZP衍生物靶向IKKβ对HIEC和THP-1细胞中NF-κB激活的影响

A–D通过WB检测HIECs中p-p65和p65的表达，及其统计学数据（n = 3，每组）。E, FHIECs中p65的免疫荧光表达，及其统计学数据（n = 3，每组）。G–M通过WB检测THP-1细胞中p-p65、p65、p-IKKβ、IKKβ的表达，及其统计学数据（n = 3，每组）。N, O高内涵筛选系统对THP-1细胞中p65表达的荧光检测，及其统计学数据（n = 3，每组）。单因素方差分析结合Dunnett多重比较检验。*p < 0.05, **p < 0.01，与对照组相比； < 0.05, # < 0.01, 与5-FU组或LPS + IFN-γ组相比。

图7：Rhamnocitrin和Toralactone对IKKβ的靶向效应与相互作用模式

A, B 使用WB检测转染过表达IKKβ（OE-IKKβ）质粒的HEK293T细胞中IKKβ的表达，并进行统计分析（n = 3，每组）。 C–F 使用WB检测在不同浓度TNF-α干预24小时后，OE-IKKβ HEK293T细胞中p-IKKβ和IKKβ的表达，并进行统计分析（n = 3，每组）。 G–J 使用WB检测与10 ng/mL TNF-α同时处理的OE-IKKβ HEK293T细胞中，Rhamnocitrin和Toralactone对p-IKKβ和IKKβ表达的影响，并进行统计分析（n = 3，每组）。 K Rhamnocitrin和Toralactone与IKKβ的蛋白质-配体相互作用分析。 L IKKβ和Rhamnocitrin/Toralactone复合物在100 ns时的MD模拟分析。 M IKKβ-Rhamnocitrin/Toralactone复合物的吉布斯自由能分析。 N SPR测定Rhamnocitrin和Toralactone与IKKβ的结合动力学。单向方差分析结合Dunnett多重比较检验。 *p < 0.05, **p < 0.01，与NC组、TNF-α 0 ng/mL组或TNF-α 10 ng/mL组相比。

PART 06

结论

GQBZP通过双重机制缓解5-FU诱导的IM：它通过IKKβ/NF-κB依赖性机制抑制肠道黏膜巨噬细胞的M1极化，同时通过IKKβ/NF-κB非依赖性途径保护小肠上皮细胞（图 8）。在活性成分中，Toralactone作为直接的IKKβ抑制剂，而Rhamnocitrin可能通过调节上游信号通路或脱靶作用发挥其作用。这些发现支持GQBZP在管理5-FU诱导的CIM方面的治疗潜力

机制解析

归芪白术方（GQBZP）发挥双重保护：

1.保护小肠上皮细胞：以不依赖IKKβ/NF‑κB的途径，减少上皮凋亡，修复肠道紧密连接屏障；

2.靶向巨噬细胞抑制炎症：方中大黄内酯直接结合抑制IKKβ，鼠李柠檬素等间接调控，抑制IKKβ/NF‑κB通路，阻断M1巨噬细胞过度极化，减少大量促炎因子释放，减轻肠道炎症损伤，改善5‑FU化疗性肠黏膜炎。

一图概括

科研启示｜这篇文章值得我们借鉴的思路

1.严谨的靶点确证逻辑：没有止步于“网络药理学+分子对接”，进一步用SPR表面等离子体共振、分子动力学、蛋白过表达细胞区分小分子是直接结合靶点，还是间接效应，规避很多中药研究只靠对接就宣称“直接靶点”的缺陷。

2.细胞分层解析炎症来源：区分上皮细胞与巨噬细胞，发现5‑FU诱导肠黏膜炎中，NF‑κB通路激活主要发生在巨噬细胞，上皮本身并不激活该通路，更新对化疗肠黏膜炎炎症来源的理解。

3.复方双重保护思路：同时兼顾「肠道屏障修复」+「免疫巨噬细胞极化调控」，契合中药复方多靶点特点。

4.临床转化价值：针对肿瘤化疗常见并发症化疗性肠黏膜炎，提供中药活性物质基础，大黄内酯可作为后续先导化合物开发的候选分子。

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PART 07

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